HISZTON 4 ARGININ3 METILáCIóS
HELYEK
TéRKéPEZéSE A
HUMáN GENOMBAN IMMUNPRECIPITáCIóVAL
éS
IN SILICO ANALíZISSEL
Szerző: GÁBOR Petra V.
évfolyam
Témavezető: Dr. NAGY
László, Dr. BÁLINT B.
László
Intézmény: Debreceni Egyetem, Orvos- és
Egészségtudományi
Centrum, általános
Orvostudományi
Kar,
Biokémiai és
Molekuláris Biológiai
Intézet, Debrecen
A humán genom
szekvenciájának
meghatározása után, ma az
elsődleges cél a genom és
szabályozó faktorainak
pontos funkcionális
leírása. Munkacsoportunk
korábbi eredményei
mutatják, hogy a
hisztonmetiláció
mértéke, mely egy pozitív
szabályozó mechanizmus,
fokozható DMSO-val
(dimetil-szulfoxiddal) történő
előkezeléssel myeloid
leukémia sejtvonalakon.
Kvantitatív PCR-ral és DNS chippel
végzett mRNS vizsgálatok után,
jelen kísérletben teljes genomi
szekvencia analízissel
próbáltunk meg újabb
információkat nyerni a
hisztonmetiláció
szerepéről.
A kísérlet során
HL60 CDM1 sejteket kezeltünk DMSO-val, majd
kromatin-immunprecipitációs
technikával kinyertük azokat a
DNS szakaszokat, amelyekhez a
kezelés hatására Arg3-on
metilálódott H4 hisztonok
kötődtek. Ezeket pCR-blunt plazmidokba
ligáltuk és
felszaporítottuk.
Feldolgozás után az inzertet
tartalmazó plazmidokat
megszekvenáltattuk. A kapott
szekvenciák elemzését
különböző, az interneten
elérhető programok
segítségével
végeztük (NCBI Blast, UCSC Human Genom Browser,
Genelynx stb.)
A 118 feldolgozott
plazmidból 57 tartalmazott inzertet
(48,3%) és ezek közül 48 (84,2%) humán
szekvenciát. Az elemzés során
10 repetitív szekvenciát
találtunk, míg 38 helyét
pontosan tudtuk lokalizálni.
Utóbbiak közül 26
önálló
lokalizációt mutatott, a
maradék 12 ezek
ismétlődése volt.
Megvizsgálva a 26 szekvencia
környezetét 19
közelében valódi gént
(mRNS vagy EST), 6 közelében
prediktív gént, 1 szekvencia
környezetében (+/- 105 bp) pedig
csak egér homológiát mutató
szakaszt találtunk. A génközeli
szekvenciák közül 14 volt
intronialis, 5 helyezkedett el a
géntől 5’ és ugyanennyi
3’ irányban és csak 1 exoniálisan -
azaz génen belül. Az így
azonosított gének
némelyikének
funkciója is ismert pl: IL1a,
IL1RAPL-2,kadherin-23, DCAMKL-1 ser/thr kináz és
mások. Eredményeink azt
mutatják, hogy a felvázolt
kísérleti módszer
alkalmas arra, hogy pontosan
feltérképezhessük a
különbőző DNS-hez
kötődő szabályozó
faktorok (transzkripciós
faktorok, magreceptorok) genomi
célpontjait, ami új
dimenzióját adja a
génexpresszió
szabályozás
vizsgálatának.
Kulcsszavak: H4
hiszton Arg3, immunprecipitáció,
szekvenálás, in silico analízis
Mapping of methylation sites of
histone H4 Arginine
in the human genom through
Immunprecipitation and
in Sililco Analysis
Author: GÁBOR Petra 5th year
student
Supervisor: Dr. NAGY László professor assistant, Dr. BÁLINT B. László Phd student
Institution: University
of Debrecen, Medical and Health Science
Center
Biochemistry and Molecular
Biology Department, Debrecen
After finishing sequencing the human
genom nowadays primary task is to describe it and its
regulating factors exactly and
functionally.
Our previous results showed that the level
of histone methylation, which is regarded as an
important positive regulating
mechanism, can be increased by DMSO
(dimethyl-sulphoxide). The aim of our present
experiment was to gain new informations on the role of
histone methylation through total sequence analysis of
the human genom.
Using the X-CHIP technique (chromatin
immunprecipitation) we separated all
those DNA fragments which were attached to
hypermethylated histone H4 Arg sites after the
DMSO treatment on CDM1 human leukemia cells. The
separated DNA fragments were ligated into
pCR-blunt plasmids then sequenced. The in silico
analysis involved the identification and
localization of the sequences by using various
internet programs (NCBI Blast, UCSC Human Genom Browser,
Genelynx).
The effiency of ligation was 40,67 %
(from 118 plasmids 48 contained human sequence). The
analysis found 26 unique, 12 repeated unique and 10
repetitive sequences. The ±105 bp
environment of 19 unique sequence contained real gene (mRNA
or EST), of 6 predictive gene and 1 had nothing more
but mouse-homology. Among the gene related sequences
there were 14 intronial, 5-5 to 5 and 3 direction from the
genes, only 1 was exonial. The function some identified
gene is well-known like the IL1a, IL1RAPL-2, cadherin-23,
DCAMKL-1, AMPH. Our results demonstrate that the described
methode including the X-CHIP and in silico
analysis is suitable for mapping the genomic
targets of different regulating factors
(transcription factors, nuclear receptors) opening
new dimensions of experiments on regulation
of gene expression.