A LOXL éLESZTő KéT
HIBRID SZűRéSE
Szerző: BARNA János IV.
évfolyam
Témavezető: Keith FONG Ph.D.
Intézmény: Pacific Biomedical Research Center, John
A. Burns School of Medicine,
University of
Hawaii, Honolulu
A lizil-oxidáz like
fehérje (LOXL), egy amin-oxidáz, mely a
lizil-oxidázhoz (LOX) való
hasonlóságának okán
kapta nevét. A LOX jól ismert,
régóta kutatott fehérje. A
fibrilláris kollagén és elasztin
molekulák közötti
keresztkötések
létrejöttét
katalizálja, oly módon, hogy az
említett molekulák lizil és
hidroxi-lizil oldalláncait
oxidatívan dezaminálja. A 90-es
évek óta több olyan gént is
találtak, melyek a LOX-hoz hasonló
fehérjéket kódolnak.
Köztük volt a LOXL is. Ezek a
karboxi-terminális aminosav
szekvenciájában
jelentős homológia
tapasztalható, míg az
N-terminális szekvencia igen
eltérő is lehet. A
katalízis a C-terminushoz
köthető. Számos
publikáció utal arra, hogy a LOX-nak
illetve a vele homológiát
mutató többi enzimnek nemcsak az
említett katalízisben
lehet szerepe, hanem amin-oxidáz
aktivitása révén más
folyamatokban is részt vehet. A LOX
processzált formáját
például a sejtmagban is
lokalizálták. Annak
érdekében, hogy többet tudjunk
meg a LOXL funkciójáról,
élesztő két hibrid
szűréssel vele
kölcsönható
fehérjéket kerestünk.
A LOXL gén N-terminális
részét pGBKT7 csali vektorba
klónoztuk. A szűréshez a
Matchmaker Gal4 III rendszert használtuk
(Clonetech). Az AH109 élesztő
sejtvonalat transzformáltuk a
csali konstrukttal majd placenta cDNS
könyvtárral. A W-L- aminosavhiányos
lemezeken kinövő
telepekből izoláltuk a
plazmidot és PCR-rel amplifikáltuk
őket. Agaróz
gélelektroforézissel
elkülönítettük az
azonos méretű inzerteket
tartalmazó plazmidokat. Az
inzerteket megszekvenáltuk és az NCBI
adatbázisa
segítségével
kikerestük a nekik megfelelő
proteineket.
A szűrés során 30
konstruktot szekvenáltunk meg. Tíz
esetben találtuk meg a fibronektint
négyben a kollagén Iá1
láncát. Ezeken kívül
további fehérjéket is
találtunk. A fibronektin és a
kollagénI.á1extracelluláris
mátrixalkotó, tehát a
kölcsönhatásnak van
relevanciája.
Kulcsszvak: lizil
oxidáz, élesztő két hibrid,
amin-oxidáz
YEAST TWO HYBRID SCREENING OF LOXL
Author: János BARNA IVth year
undergraduate student
Supervisor: Keith FONG PhD, university
professor
Institution: Pacific
Biomedical Research Centre, John A. Burns School of
Medicine,
University of Hawaii,
Honolulu
The lysil-oxidase protein (LOXL)
is an amine-oxidase named after a similar
protein called lysil-oxidase (LOX). LOX is a
well-known enzyme required for the formation of
lysine-derived cross-links in collagen and elastin. Since the
’90s several genes have been found encoding
proteins that resemble LOX. One of these was LOXL. All these
proteins have sequence homology corresponding
to the C-terminal part of LOX, which is important for its
catalysis, while there are differences at the
N-terminus. According to several
publications, LOX and the related proteins
may have other functions as well, being
amine-oxidases. A processed form of LOX for example was
localized in the nucleus. In order to know more about the
function of LOXL we performed a yeast two-hybrid screen to
identify proteins which interact with it.
The N-terminal part of LOXL was cloned into
the pGBKT7 bait vector. We used the Matchmaker Gal4 III.
System (Clonetech) for the screen. AH109 cell line was
transformed by the bait construct and by the placenta
cDNA library. We isolated the constructs from colonies
growing on W-L- dropout plates and amplified the insert by PCR.
We were able to select the plasmids containg inserts with the
same sizes using agarose gel electrophoresis. The inserts were
sequenced and with the help of NCBI database we could
identify the corresponding protein.
We sequenced 30 constructs during the
screen. In ten cases we identified fibronectin and in four cases
collagene Iá1 chain. We found other proteins as well.
The fibronectin and the collagene Iá1 are
extracellular matrix proteins, so the
interaction has relevance.
Keywords: lysil-oxidase,
yeast two hybrid, amine-oxidase