A LOXL éLESZTő KéT HIBRID SZűRéSE
Szerző: BARNA János IV. évfolyam
Témavezető: Keith FONG Ph.D.
Intézmény: Pacific Biomedical Research Center, John A. Burns School of Medicine,
University of Hawaii, Honolulu

A lizil-oxidáz like fehérje (LOXL), egy amin-oxidáz, mely a lizil-oxidázhoz (LOX) való hasonlóságának okán kapta nevét. A LOX jól ismert, régóta kutatott fehérje. A fibrilláris kollagén és elasztin molekulák közötti keresztkötések létrejöttét katalizálja, oly módon, hogy az említett molekulák lizil és hidroxi-lizil oldalláncait oxidatívan dezaminálja. A 90-es évek óta több olyan gént is találtak, melyek a LOX-hoz hasonló fehérjéket kódolnak. Köztük volt a LOXL is. Ezek a karboxi-terminális aminosav szekvenciájában jelentős homológia tapasztalható, míg az N-terminális szekvencia igen eltérő is lehet. A katalízis a C-terminushoz köthető. Számos publikáció utal arra, hogy a LOX-nak illetve a vele homológiát mutató többi enzimnek nemcsak az említett katalízisben lehet szerepe, hanem amin-oxidáz aktivitása révén más folyamatokban is részt vehet. A LOX processzált formáját például a sejtmagban is lokalizálták. Annak érdekében, hogy többet tudjunk meg a LOXL funkciójáról, élesztő két hibrid szűréssel vele kölcsönható fehérjéket kerestünk.
A LOXL gén N-terminális részét pGBKT7 csali vektorba klónoztuk. A szűréshez a Matchmaker Gal4 III rendszert használtuk (Clonetech). Az AH109 élesztő sejtvonalat transzformáltuk a csali konstrukttal majd placenta cDNS könyvtárral. A W-L- aminosavhiányos lemezeken kinövő telepekből izoláltuk a plazmidot és PCR-rel amplifikáltuk őket. Agaróz gélelektroforézissel elkülönítettük az azonos méretű inzerteket tartalmazó plazmidokat. Az inzerteket megszekvenáltuk és az NCBI adatbázisa segítségével kikerestük a nekik megfelelő proteineket.
A szűrés során 30 konstruktot szekvenáltunk meg. Tíz esetben találtuk meg a fibronektint négyben a kollagén Iá1 láncát. Ezeken kívül további fehérjéket is találtunk. A fibronektin és a kollagénI.á1extracelluláris mátrixalkotó, tehát a kölcsönhatásnak van relevanciája.
Kulcsszvak: lizil oxidáz, élesztő két hibrid, amin-oxidáz










YEAST TWO HYBRID SCREENING OF LOXL
Author: János BARNA IVth year undergraduate student
Supervisor: Keith FONG PhD, university professor
Institution: Pacific Biomedical Research Centre, John A. Burns School of Medicine,
University of Hawaii, Honolulu

The lysil-oxidase protein (LOXL) is an amine-oxidase named after a similar protein called lysil-oxidase (LOX). LOX is a well-known enzyme required for the formation of lysine-derived cross-links in collagen and elastin. Since the ’90s several genes have been found encoding proteins that resemble LOX. One of these was LOXL. All these proteins have sequence homology corresponding to the C-terminal part of LOX, which is important for its catalysis, while there are differences at the N-terminus. According to several publications, LOX and the related proteins may have other functions as well, being amine-oxidases. A processed form of LOX for example was localized in the nucleus. In order to know more about the function of LOXL we performed a yeast two-hybrid screen to identify proteins which interact with it.
The N-terminal part of LOXL was cloned into the pGBKT7 bait vector. We used the Matchmaker Gal4 III. System (Clonetech) for the screen. AH109 cell line was transformed by the bait construct and by the placenta cDNA library. We isolated the constructs from colonies growing on W-L- dropout plates and amplified the insert by PCR. We were able to select the plasmids containg inserts with the same sizes using agarose gel electrophoresis. The inserts were sequenced and with the help of NCBI database we could identify the corresponding protein.
We sequenced 30 constructs during the screen. In ten cases we identified fibronectin and in four cases collagene Iá1 chain. We found other proteins as well. The fibronectin and the collagene Iá1 are extracellular matrix proteins, so the interaction has relevance.
Keywords: lysil-oxidase, yeast two hybrid, amine-oxidase