A kutatás célja egy T-DNS inszerciós mutagenézissel előállított ABC transzporter mutáns jellemzése, valamint a gén funkciójának és szabályozásának meghatározása.
Alkalmazott módszerek: Arabidopsis thaliana et. Columbia transzformálása vákuum infiltrációs módszerrel készült Agrobacterium thumefaciens segítségével. A DNS izolálás CTAB módszerrel lett végrehajtva. A promóter pBin LUC+ vektorral lett klónozva. A PCR technikák Zenon dupla Taq polimerázzal elkészítve, a gyártó utasításai szerint. A luciferáz aktivitásméréseknél luciferin szubsztrát adása után a biolumineszcencia CCD kamera segítségével került detektálásra.
Elért eredmények: a 213-as inszerciós mutánsban a T-DNS melletti genomikus régiókat TAIL-PCR segítségével izoláltuk, és direkt szekvenálással meghatároztuk az inszerció pontos helyét. A szekvencia analízis eredménye arra utalt, hogy a T-DNS az At1g17840-es gén 5' upstream régiójában a 12-es intron részébe épült be. Az adatbázis szerint ez egy ABC transzporter típusú gén.
A transzformáns növény minden szövetében megfigyelhető a lumineszcencia, kivéve a gyökeret. 16 órás mérések után megváltozott luciferáz aktivitás tapasztalható: NaCl, glükóz, mannitol és ABA kezelés hatására expressziós csúcs volt látható, ami 6 óra elteltével lecsengett.
A gén promóter analízise céljából A. thaliana növényben PCR segítségével felamplifikáltuk az At1g17840-es gén 1200 bázispár hosszú promóter szakaszát, majd pBin LUC+ vektorba építettük be. Ezután a transzgénikus növényvonalak Agrobacterium transzformálással készültek. A transzformáns növények tesztelése folyamatban van.
A mutáns növények fenotípusos vizsgálatához csírázási tesztet végeztünk 23 féle táptalajon (9 féle hormon, cukrok, só, herbicidek, gátlószerek, nehézfémek) in vitro és in vivo. A mutáns nem mutatott a vad típusú növénytől eltérő érzékenységet.
Következtetések: a promóter csapdázás alkalmas stressz indukált génekben mutáns- izolálásra és transzkripciót szabályozó régiók azonosítására.

Kulcsszavak: T-DNS inszerciós mutagenézis, luciferáz aktivitásmérés, promóter klónozás

 

 

 

KARAKTERISTIKE JEDNOG ARABIDOPSISA SA STANOVIŠTA ABC MUTANTNOG TRANSPORTERA
Autor: Eva Boršoš
Mentor: Dr. Laslo Sabadoš, vodič grupa
Institut: Fakultet u Segedinu, Prirodno-matematički odsek, Departmant za biologiju, Segedin

Cilj istraživanja: karakterisiranje jednog ABC transporterskog mutanta koji je napravljen sa T-DNK insercionom mutageniziranjem, kao i određivanje njegove funkcije i regulisanja.
Primenjeni metodi: transformacije Arabidopsis thaliana et. Columbia napravili smo sa vakuminarom infiltracijom sa Agrobacterium thumefaciens. Izolaciju DNK izvršili smo metodom CTAB. Za kloniranje promotera primenili smo pBin LUC+ vektor. Za PCR tehniku upotrebili smo Zenon dvostruki Taq polimerazu po unapred određenim načinom. Merenje aktivnosti luciferaza napravili smo posle davanja luciferin substrata, CCD kamerom detektovali smo bioluminescenciju.
Postignuti rezultati: iz L213 insercionim mutantom izolovali smo genomne regije pored T-DNK insercije sa TAIL-PCR-om i sa direktnom sekvencijom odredili tačno mesto insercije. Rezultat analize sekvencije ukazuje da se T-DNK nalazi u genu At1g17840 i ugrađuje se u pravcu 5` upstream u UTR sekvencije. Prema bazi podataka saznali smo da je to jedan gen tipa ABC transportera.
Luminescenciju možemo posmatrati u svim tkivama transformisanog bilja osim u korenu. Posle 16 sati merenja konstatovali smo promenjenu aktivnost luciferaza, tretiranjem sa NaCl-om, glukozom, mannitolom i ABA-om video se ekspresijski vrh, koji je posle 6 sati nestao.
U cilju analize genskog promotera u biljku A. Thaliana pomoću PCR-a pojačali smo 1200 baznih parova dugačak deo promotera u genu At1g17840 i ugradili smo u pBinLUC+ vektoru. Posle toga smo napravili transgenske biljne linije sa transformiranjem Agrobacteriuma. Testiranje transgenske linije je u toku.
Za istraživanje fenotipa mutantne biljke na 23 vrste podloga zvršili smo test za klijanje (9 vrsta hormona, šećera, soli, herbicide, sprečavajuća sredstva, teške metale) in vitro i in vivo. Mutantna biljka nije pokazala različitu osetljivost od divlje biljke.
Zaključak: ovaj postupak je primenljiiv za izolaciju mutanta štresom indukovanih gena i za detekciju takvih regija koje regulišu transkripciju.

Ključne reči: T-DNK insercioni mutageniranje, merenje aktivnosti luciferaza, kloniranje promotera

 

 

 

 

The aim of the research: characterization of an ABC transporter mutant, made by means of T-DNA insertion mutagenesis, and determination of the function and the regulation of the gene.
Applied methods: the transformation of Arabidopsis thaliana et. Columbia was done with vacuum infiltration. For promoter cloning pBinLuc+ vector was used. PCR technics were made with Zenon double Taq polimeraze, according to the manufacturer's instructions. At luciferase measuring, bioluminescence was detected with CCD camera after giving luciferase substrate.
Results: the genomic regions beside the T-DNA insertion were isolated with TAIL-PCR in insertion mutant named 213, and the exact place of the insertion was determined with direct sequencing. The result of sequence analysis showed that the T-DNA sequence was infiltrated into 5' upstream region of gene numbered At1g17840 into UTR sequence. According to the database, it is an ABC transporter gene.
Luminescency can be detected in every tissue of the transformant plant apart from the root. After 16-hour long measurings the luciferin activity changed: there was an expression peak after NaCl, glucoze, mannitol and ABA treatments, which stopped after 6 hours.
To analyze the promoter of the gene, the 1200 bp long promoter region of the gene At1g17840 was amplified with PCR in A. thaliana wild type plant, then it was built into pBinLuc+ vector. Then transgenic plant lines were made with Agrobacterium thumefaciens transformation. The testing of transformant plants is in progress.
To analyze the phenotype of mutant plants, a germination test was made on 23 different media (9 hormones, sugars, salt, herbicides, impeding materials, heavy metals) in vivo and in vitro. The sensitivity of the mutant plant did not differ from that of the wild type plant.
Conclusions: promoter trapping can be used to isolate stress-induced mutant genes and to identify regions which regulate the transcription.

Keywords: T-DNA insertion mutagenesis, measuring luciferase activity, promoter cloning